Тестування метилювання ДНК у поєднанні зі смартфонами для раннього скринінгу пухлин та лейкемії з точністю 90,0%!

Раннє виявлення раку на основі рідкої біопсії – це новий напрямок виявлення та діагностики раку, запропонований Національним інститутом раку США в останні роки з метою виявлення раннього раку або навіть передракових уражень. Він широко використовується як новий біомаркер для ранньої діагностики різних злоякісних новоутворень, включаючи рак легенів, пухлини шлунково-кишкового тракту, гліоми та гінекологічні пухлини.

Поява платформ для ідентифікації біомаркерів метилювального ландшафту (Methylscape) має потенціал значно покращити існуючий ранній скринінг на рак, що дозволить пацієнтам виявитися на найпершій стадії, придатній для лікування.

Нещодавно дослідники розробили просту та прямий сенсорний майданчик для виявлення ландшафту метилювання на основі золотих наночастинок, декорованих цистеаміном (Cyst/AuNPs), у поєднанні з біосенсором на базі смартфона, що дозволяє проводити швидкий ранній скринінг широкого спектру пухлин. Ранній скринінг на лейкемію можна проводити протягом 15 хвилин після екстракції ДНК зі зразка крові з точністю 90,0%. Назва статті: Швидке виявлення ракової ДНК у крові людини за допомогою AuNPs, покритих цистеаміном, та смартфона з підтримкою машинного навчання.

Рисунок 1. Проста та швидка платформа для скринінгу раку за допомогою компонентів Cyst/AuNPs може бути створена за два простих кроки.

Це показано на рисунку 1. Спочатку для розчинення фрагментів ДНК було використано водний розчин. Потім до змішаного розчину було додано Cyst/AuNPs. Нормальна та злоякісна ДНК мають різні властивості метилювання, що призводить до утворення фрагментів ДНК з різними моделями самозбірки. Нормальна ДНК агрегує слабо та зрештою агрегує Cyst/AuNPs, що призводить до червоного зсуву Cyst/AuNPs, так що зміну кольору з червоного на фіолетовий можна спостерігати неозброєним оком. Навпаки, унікальний профіль метилювання ракової ДНК призводить до утворення більших кластерів фрагментів ДНК.

Зображення 96-лункових планшетів були зроблені за допомогою камери смартфона. ДНК раку вимірювали за допомогою смартфона, оснащеного машинним навчанням, порівняно з методами на основі спектроскопії.

Скринінг раку в реальних зразках крові

Щоб розширити можливості сенсорної платформи, дослідники застосували датчик, який успішно розрізняв нормальну та ракову ДНК у реальних зразках крові. Патерни метилювання в сайтах CpG епігенетично регулюють експресію генів. Майже у всіх типах раку спостерігалося чергування змін у метилюванні ДНК, а отже, і в експресії генів, що сприяють пухлиногенезу.

Як модель для інших видів раку, пов'язаних з метилюванням ДНК, дослідники використовували зразки крові пацієнтів з лейкемією та здорових людей контрольної групи, щоб дослідити ефективність ландшафту метилювання в диференціації лейкемічних видів раку. Цей біомаркер ландшафту метилювання не тільки перевершує існуючі методи швидкого скринінгу на лейкоз, але й демонструє можливість поширення цього простого та зрозумілого аналізу на раннє виявлення широкого спектру видів раку.

Було проаналізовано ДНК зразків крові 31 пацієнта з лейкемією та 12 здорових осіб. Як показано на блоковій діаграмі на рисунку 2a, відносне поглинання зразків раку (ΔA650/525) було нижчим, ніж у ДНК нормальних зразків. Це було головним чином пов'язано з підвищеною гідрофобністю, що призводило до щільної агрегації ракової ДНК, що запобігало агрегації Cyst/AuNPs. В результаті ці наночастинки були повністю дисперговані у зовнішніх шарах ракових агрегатів, що призвело до різної дисперсії Cyst/AuNPs, адсорбованих на агрегатах нормальної та ракової ДНК. Потім ROC-криві були побудовані шляхом зміни порогу від мінімального значення ΔA650/525 до максимального значення.

Рисунок 2.(a) Відносні значення поглинання розчинів цист/AuNPs, що показують наявність нормальної (синій) та ракової (червоний) ДНК за оптимізованих умов

(DA650/525) коробкових діаграм; (b) ROC-аналіз та оцінка діагностичних тестів. (c) Матриця плутанини для діагностики здорових пацієнтів та пацієнтів з раком. (d) Чутливість, специфічність, позитивна прогностична цінність (ППЦ), негативна прогностична цінність (НПЦ) та точність розробленого методу.

Як показано на рисунку 2b, площа під ROC-кривою (AUC = 0,9274), отримана для розробленого сенсора, продемонструвала високу чутливість та специфічність. Як видно з коробкової діаграми, найнижча точка, що представляє нормальну групу ДНК, недостатньо чітко відокремлена від найвищої точки, що представляє групу ракової ДНК; тому для розмежування нормальної та ракової груп було використано логістичну регресію. Враховуючи набір незалежних змінних, вона оцінює ймовірність настання події, такої як рак або нормальна група. Залежна змінна коливається від 0 до 1. Таким чином, результатом є ймовірність. Ми визначили ймовірність виявлення раку (P) на основі ΔA650/525 наступним чином.

де b=5,3533, w1=-6,965. Для класифікації зразків ймовірність менше 0,5 вказує на нормальний зразок, тоді як ймовірність 0,5 або вище вказує на зразок раку. На рисунку 2c зображено матрицю плутанини, отриману в результаті перехресної валідації без урахування методу, яка була використана для перевірки стабільності методу класифікації. На рисунку 2d підсумовано оцінку діагностичного тесту методу, включаючи чутливість, специфічність, позитивну прогностичну цінність (ППЦ) та негативну прогностичну цінність (НПЦ).

Біосенсори на базі смартфонів

Щоб ще більше спростити тестування зразків без використання спектрофотометрів, дослідники використали штучний інтелект (ШІ) для інтерпретації кольору розчину та розрізнення нормальних та ракових осіб. З огляду на це, комп'ютерний зір був використаний для перетворення кольору розчину Cyst/AuNPs на нормальну ДНК (фіолетовий) або ракову ДНК (червоний) за допомогою зображень 96-лункових планшетів, зроблених за допомогою камери мобільного телефону. Штучний інтелект може знизити витрати та покращити доступність інтерпретації кольору розчинів наночастинок без використання будь-яких оптичних аксесуарів для смартфонів. Нарешті, дві моделі машинного навчання, включаючи Random Forest (RF) та Support Vector Machine (SVM), були навчені для побудови моделей. Як моделі RF, так і SVM правильно класифікували зразки як позитивні та негативні з точністю 90,0%. Це свідчить про те, що використання штучного інтелекту в біосенсориці на основі мобільних телефонів цілком можливе.

Рисунок 3.(a) Цільовий клас розчину, записаний під час підготовки зразка для етапу отримання зображення. (b) Приклад зображення, зробленого під час етапу отримання зображення. (c) Інтенсивність кольору розчину цисти/AuNPs у кожній лунці 96-лункового планшета, витягнутого з зображення (b).

Використовуючи Cyst/AuNPs, дослідники успішно розробили просту сенсорну платформу для виявлення ландшафту метилювання та датчик, здатний розрізняти нормальну ДНК від ракової при використанні реальних зразків крові для скринінгу лейкемії. Розроблений датчик продемонстрував, що ДНК, виділена з реальних зразків крові, здатна швидко та економічно ефективно виявляти невеликі кількості ракової ДНК (3 нМ) у пацієнтів з лейкемією за 15 хвилин та показала точність 95,3%. Для подальшого спрощення тестування зразків шляхом усунення потреби в спектрофотометрі було використано машинне навчання для інтерпретації кольору розчину та диференціації нормальних та ракових осіб за допомогою фотографії мобільного телефону, і також вдалося досягти точності 90,0%.

Посилання: DOI: 10.1039/d2ra05725e