Фактори інтерференції в ПЛР-реакціях

Під час ПЛР-реакції часто зустрічаються деякі фактори, що заважають.
Через дуже високу чутливість ПЛР, забруднення вважається одним із найважливіших факторів, що впливають на результати ПЛР, і може призвести до хибнопозитивних результатів.
Не менш важливими є різні джерела, які призводять до хибнонегативних результатів. Якщо одна або декілька важливих частин ПЛР-суміші або сама реакція ампліфікації інгібуються або порушуються, діагностичний аналіз може бути утруднений. Це може призвести до зниження ефективності та навіть хибнонегативних результатів.
Окрім інгібування, втрата цілісності цільової нуклеїнової кислоти може статися через умови транспортування та/або зберігання перед підготовкою зразка. Зокрема, високі температури або неналежне зберігання можуть призвести до пошкодження клітин і нуклеїнових кислот. Фіксація клітин і тканин і заливка парафіном є добре відомими причинами фрагментації ДНК і постійною проблемою (див. Рисунки 1 і 2). У цих випадках навіть оптимальна ізоляція та очищення не допоможуть.

Рисунок 1 | Вплив іммобілізації на цілісність ДНК
Електрофорез в агарозному гелі показав, що якість ДНК, виділеної з парафінових зрізів аутопсій, значно варіювалася. ДНК з різною середньою довжиною фрагментів була присутня в екстрактах залежно від методу фіксації. ДНК зберігалася лише за умови фіксації в нативних заморожених зразках та в буферному нейтральному формаліні. Використання сильнокислотного фіксатора Буена або небуферизованого формаліну, що містить мурашину кислоту, призвело до значної втрати ДНК. Решта фракції є сильно фрагментованою.
Ліворуч довжина фрагментів виражена в кілобазних парах (kbp)

Рисунок 2 | Втрата цілісності нуклеїнових кислот-мішеней
(a) Розрив 3′-5′ на обох ланцюгах призведе до розриву цільової ДНК. Синтез ДНК все одно відбуватиметься на малому фрагменті. Однак, якщо на фрагменті ДНК відсутній сайт відпалу праймерів, відбувається лише лінійна ампліфікація. У найсприятливішому випадку фрагменти можуть відновлювати насичення один одного, але вихід буде малим і нижчим за рівень виявлення.
(b) Втрата основ, головним чином через депуринацію та утворення тимідинового димеру, призводить до зменшення кількості водневих зв'язків та зниження Tm. Під час подовженої фази нагрівання праймери плавляться від матричної ДНК і не відпалюють навіть за менш суворих умов.
(c) Сусідні тимінові основи утворюють ТТ-димер.
Ще однією поширеною проблемою, яка часто виникає в молекулярній діагностиці, є неоптимальне вивільнення цільових нуклеїнових кислот порівняно з фенол-хлороформною екстракцією. У крайніх випадках це може бути пов'язано з хибнонегативними результатами. Багато часу можна заощадити за допомогою лізису кип'ятінням або ферментативного розщеплення клітинних залишків, але цей метод часто призводить до низької чутливості ПЛР через недостатнє вивільнення нуклеїнових кислот.

Інгібування активності полімерази під час ампліфікації

Загалом, інгібування використовується як контейнерне поняття для опису всіх факторів, що призводять до неоптимальних результатів ПЛР. У суто біохімічному сенсі інгібування обмежується активністю ферменту, тобто воно зменшує або запобігає перетворенню субстрат-продукт через взаємодію з активним центром ДНК-полімерази або її кофактором (наприклад, Mg2+ для Taq ДНК-полімерази).
Компоненти зразка або різні буфери та екстракти, що містять реагенти, можуть безпосередньо інгібувати фермент або захоплювати його кофактори (наприклад, ЕДТА), тим самим інактивуючи полімеразу та, в свою чергу, призводячи до знижених або хибнонегативних результатів ПЛР.
Однак багато взаємодій між компонентами реакції та нуклеїновими кислотами, що містять мішень, також позначаються як «інгібітори ПЛР». Після того, як цілісність клітини порушується внаслідок виділення та вивільнення нуклеїнової кислоти, можуть виникнути взаємодії між зразком та навколишнім розчином і твердою фазою. Наприклад, «поглиначі» можуть зв'язуватися з одно- або дволанцюговою ДНК через нековалентні взаємодії та перешкоджати виділенню та очищенню, зменшуючи кількість мішеней, які зрештою досягають реакційної посудини для ПЛР.
Загалом, інгібітори ПЛР присутні в більшості рідин організму та реагентів, що використовуються для клінічних діагностичних тестів (сечовина в сечі, гемоглобін та гепарин у крові), харчових добавках (органічні компоненти, глікоген, жир, іони Ca2+) та компонентах навколишнього середовища (феноли, важкі метали).

Більш поширені інгібітори ПЛР можна знайти в бактеріях та еукаріотичних клітинах, нецільовій ДНК, макромолекулах тканинних матриць, що зв'язуються з ДНК, та лабораторному обладнанні, такому як рукавички та пластик. Очищення нуклеїнових кислот під час або після екстракції є кращим методом видалення інгібіторів ПЛР.
Сьогодні різноманітне автоматизоване обладнання для екстракції може замінити багато ручних протоколів, але 100% відновлення та/або очищення мішеней ніколи не було досягнуто. Потенційні інгібітори можуть все ще бути присутніми в очищених нуклеїнових кислотах або вже могли подіяти. Існують різні стратегії для зменшення впливу інгібіторів. Вибір відповідної полімерази може суттєво вплинути на активність інгібітора. Іншими перевіреними методами зменшення інгібування ПЛР є збільшення концентрації полімерази або застосування добавок, таких як BSA.
Інгібування ПЛР-реакцій можна продемонструвати за допомогою внутрішнього контролю якості процесу (ВКП).
Слід ретельно промивати ізолят нуклеїнової кислоти, видаляючи всі реагенти та інші розчини з набору для екстракції, такі як етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ізопропанол та фенол. Залежно від їхньої концентрації, вони можуть активувати або пригнічувати ПЛР.