Інтерференційні фактори в ПЛР-реакціях

Під час ПЛР-реакції часто зустрічаються деякі заважаючі фактори.
Через дуже високу чутливість ПЛР контамінація вважається одним із найважливіших факторів, що впливає на результати ПЛР, і може давати хибнопозитивні результати.
Не менш критичними є різні джерела, які призводять до хибнонегативних результатів. Якщо одна або кілька важливих частин суміші ПЛР або сама реакція ампліфікації пригнічуються або заважають, діагностичний аналіз може бути перешкоджений. Це може призвести до зниження ефективності та навіть хибнонегативних результатів.
Окрім інгібування, втрата цілісності цільової нуклеїнової кислоти може статися через умови транспортування та/або зберігання до підготовки зразка. Зокрема, високі температури або неналежне зберігання можуть призвести до пошкодження клітин і нуклеїнових кислот. Фіксація клітин і тканин і заливка в парафін є добре відомими причинами фрагментації ДНК і постійною проблемою (див. малюнки 1 і 2). У цих випадках навіть оптимальна ізоляція та очищення не допоможуть.

Малюнок 1 | Вплив іммобілізації на цілісність ДНК
Електрофорез у агарозному гелі показав, що якість ДНК, виділеної з парафінових зрізів розтинів, значно різнилася. Залежно від способу фіксації в екстрактах була присутня ДНК різної середньої довжини фрагментів. ДНК зберігалася лише при фіксації в нативних заморожених зразках і в забуференому нейтральному формаліні. Використання сильнокислого фіксатора Буена або небуферизованого формаліну, що містить мурашину кислоту, призвело до значної втрати ДНК. Фракція, що залишилася, сильно фрагментована.
Зліва довжина фрагментів виражена в парах кілобаз (kbp)

Малюнок 2 | Втрата цілісності мішеней нуклеїнових кислот
(a) Розрив 3′-5′ на обох ланцюгах призведе до розриву цільової ДНК. синтез ДНК все одно відбуватиметься на маленькому фрагменті. Однак, якщо на фрагменті ДНК відсутній сайт відпалу праймера, відбувається лише лінійна ампліфікація. У найсприятливішому випадку фрагменти можуть повторно наситити один одного, але вихід буде малим і нижчим за рівень виявлення.
(b) Втрата основ, головним чином через депуринацію та утворення димеру тимідину, призводить до зменшення кількості Н-зв’язків і зниження Tm. Під час подовженої фази нагрівання праймери будуть танути з матричної ДНК і не відпалюватимуться навіть за менш суворих умов.
(c) Сусідні основи тиміну утворюють димер ТТ.
Іншою поширеною проблемою, яка часто виникає в молекулярній діагностиці, є неоптимальне вивільнення цільових нуклеїнових кислот порівняно з фенол-хлороформною екстракцією. У крайніх випадках це може бути пов’язано з помилковими негативними результатами. Багато часу можна заощадити шляхом кип’ятіння лізису або ферментативного розщеплення клітинних уламків, але цей метод часто призводить до низької чутливості ПЛР через недостатнє вивільнення нуклеїнової кислоти.

Пригнічення активності полімерази під час ампліфікації

Загалом, інгібування використовується як контейнерна концепція для опису всіх факторів, які призводять до неоптимальних результатів ПЛР. У строго біохімічному сенсі інгібування обмежується активністю ферменту, тобто воно зменшує або запобігає перетворенню субстрату в продукт через взаємодію з активним центром ДНК-полімерази або її кофактора (наприклад, Mg2+ для Taq ДНК-полімерази).
Компоненти в зразку або різні буфери та екстракти, що містять реагенти, можуть безпосередньо інгібувати фермент або захоплювати його кофактори (наприклад, EDTA), тим самим інактивуючи полімеразу та, у свою чергу, призводячи до зниження або хибнонегативних результатів ПЛР.
Однак багато взаємодій між компонентами реакції та нуклеїновими кислотами, що містять мішень, також позначаються як «інгібітори ПЛР». Після того, як цілісність клітини порушується виділенням і нуклеїнова кислота вивільняється, може виникнути взаємодія між зразком і оточуючим його розчином і твердою фазою. Наприклад, «сміттяри» можуть зв’язувати одноланцюгову або дволанцюгову ДНК за допомогою нековалентних взаємодій і заважати ізоляції та очищенню, зменшуючи кількість мішеней, які зрештою досягають реакційної ємності ПЛР.
Загалом інгібітори ПЛР присутні в більшості рідин організму та реагентів, які використовуються для клінічних діагностичних тестів (сечовина в сечі, гемоглобін і гепарин у крові), дієтичних добавках (органічні компоненти, глікоген, жир, іони Ca2+) та компонентах навколишнього середовища (феноли , важкі метали)

Більш поширені інгібітори ПЛР можна знайти в бактеріях та еукаріотичних клітинах, нецільовій ДНК, ДНК-зв’язуючих макромолекулах тканинних матриць і лабораторному обладнанні, такому як рукавички та пластик. Очищення нуклеїнових кислот під час або після екстракції є кращим методом для видалення інгібіторів ПЛР.
Сьогодні різноманітне автоматизоване обладнання для екстракції може замінити багато ручних протоколів, але 100% відновлення та/або очищення мішеней ніколи не було досягнуто. Потенційні інгібітори можуть все ще бути присутніми в очищених нуклеїнових кислотах або, можливо, вже вступили в дію. Існують різні стратегії для зменшення впливу інгібіторів. Вибір відповідної полімерази може мати значний вплив на активність інгібітора. Іншими перевіреними методами зниження інгібіції ПЛР є збільшення концентрації полімерази або застосування добавок, таких як BSA.
Інгібування реакцій ПЛР можна продемонструвати за допомогою внутрішнього контролю якості процесу (IPC).
Необхідно ретельно промити всі реагенти та інші розчини в наборі для екстракції, такі як етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ізопропанол і фенол. Залежно від їх концентрації вони можуть активувати або пригнічувати ПЛР.