Фактори перешкод у реакціях ПЛР

Під час реакції ПЛР часто зустрічаються деякі перешкоджаючі фактори.
Через дуже високу чутливість ПЛР забруднення вважається одним з найважливіших факторів, що впливають на результати ПЛР і можуть дати помилкові позитивні результати.
Не менш критичними є різні джерела, які призводять до помилкових негативних результатів. Якщо одна або кілька необхідних частин ПЛР -суміші або сама реакція ампліфікації гальмуються або втручаються, діагностичний аналіз може перешкоджати. Це може призвести до зниження ефективності та навіть помилкових негативних результатів.
На додаток до гальмування, втрата цілісної цілісності нуклеїнової кислоти може відбуватися через доставку та/або умови зберігання до підготовки зразків. Зокрема, високі температури або недостатнє зберігання можуть призвести до пошкодження клітин та нуклеїнових кислот. Фіксація клітин та тканин та вбудовування парафіну - це добре відомі причини фрагментації ДНК та постійна проблема (див. Рисунки 1 та 2). У цих випадках навіть оптимальна ізоляція та очищення не допоможуть.

Малюнок 1 | Вплив іммобілізації на цілісність ДНК
Електрофорез агарозного гелю показав, що якість ДНК, виділеної з парафінових ділянок аутопсії, значно відрізняється. ДНК різної середньої довжини фрагмента була присутня в екстрактах залежно від методу фіксації. ДНК зберігали лише при фіксуванні нативних заморожених зразків та в буферному нейтральному формаліні. Застосування сильно кислотного фіксатора або небуксу, що містить мурашину кислотою формаліну, призвело до значної втрати ДНК. Решта фракції сильно фрагментована.
Ліворуч довжина фрагментів експресується в парах кілобази (КБП)

Малюнок 2 | Втрата цілісності цілей нуклеїнової кислоти
(a) Розрив 3'-5 'на обох пасм призведе до розриву цільової ДНК. Синтез ДНК все ще відбуватиметься на невеликому фрагменті. Однак якщо на фрагменті ДНК відсутній місце відпалу праймера, на фрагменті ДНК відбувається лише лінійна ампліфікація. У найбільш сприятливому випадку фрагменти можуть перенести один одного, але врожайність буде невеликою та нижче рівня виявлення.
(b) Втрата баз, головним чином через депуляцію та утворення димеру тимідину, призводить до зменшення кількості Н-зв’язків та зменшення ТМ. Під час витягнутої фази потепління праймери тануть від матричної ДНК і не відпадуть навіть у менш жорстких умовах.
(c) Суміжні тимінні основи утворюють димер TT.
Ще одна поширена проблема, яка часто виникає в молекулярній діагностиці,-це менш оптимальне вивільнення цільових нуклеїнових кислот порівняно з екстракцією фенол-хлороформ. У крайніх випадках це може бути пов'язане з помилковими негативами. Багато часу можна заощадити шляхом кипіння лізису або ферментативного перетравлення клітинних уламків, але цей метод часто призводить до низької чутливості до ПЛР через недостатнє вивільнення нуклеїнової кислоти.

Інгібування активності полімерази під час ампліфікації

Загалом, гальмування використовується як концепція контейнера для опису всіх факторів, що призводять до неоптимальних результатів ПЛР. У суворому біохімічному сенсі гальмування обмежується активністю ферменту, тобто, він зменшує або запобігає перетворенню субстрат-продукту через взаємодію з активним місцем ДНК-полімерази або її кофактора (наприклад, Mg2+ для полімерази ДНК).
Компоненти зразка або різних буферів та екстрактів, що містять реагенти, можуть безпосередньо інгібувати фермент або захоплювати його кофактори (наприклад, EDTA), тим самим інактивуючи полімеразу і, в свою чергу, що призводить до зниження або помилкових негативних результатів ПЛР.
Однак багато взаємодій між компонентами реакцій та нуклеїновими кислотами також позначаються як "інгібітори ПЛР". Після того, як цілісність клітини буде порушена виділенням і вивільняється нуклеїнова кислота, може відбутися взаємодія між зразком та його навколишнім розчином та твердою фазою. Наприклад, "відлякувачі" можуть зв'язувати одно- або дволанцюжкову ДНК за допомогою нековалентних взаємодій і втручатися в ізоляцію та очищення за рахунок зменшення кількості цілей, які врешті-решт досягають судини реакції ПЛР.
Взагалі інгібітори ПЛР присутні у більшості рідин та реагентів в організмі, які використовуються для клінічних діагностичних тестів (сечовина в сечі, гемоглобіні та гепарині в крові), дієтичні добавки (органічні компоненти, глікоген, жир, іони Са2+) та компоненти в навколишньому середовищі (феноли феноли , важкі метали)

Більш поширені інгібітори ПЛР можна знайти в бактеріях та еукаріотичних клітинах, нецільовій ДНК, ДНК-зв'язуючих макромолекулах тканинних матриць та лабораторного обладнання, таких як рукавички та пластмаси. Очищення нуклеїнових кислот під час або після екстракції є кращим методом видалення інгібіторів ПЛР.
Сьогодні різне автоматизоване обладнання для екстракції може замінити багато ручних протоколів, але 100% відновлення та/або очищення цілей ніколи не було досягнуто. Потенційні інгібітори все ще можуть бути присутніми в очищених нуклеїнових кислотах або, можливо, вже набрали чинності. Існують різні стратегії для зменшення впливу інгібіторів. Вибір відповідної полімерази може мати значний вплив на активність інгібітора. Інші перевірені методи зменшення інгібування ПЛР - це збільшення концентрації полімерази або застосування добавок, таких як BSA.
Інгібування реакцій ПЛР можна продемонструвати за допомогою внутрішнього контролю якості процесу (IPC).
Необхідно бути обережним для видалення всіх реагентів та інших розчинів у комплекті для екстракції, таких як етанол, EDTA, Cetab, Licl, Guscn, SDS, ізопропанол та фенол, із ізоляту нуклеїнової кислоти за допомогою ретельного етапу промивання. Залежно від їх концентрації, вони можуть активувати або інгібувати ПЛР.